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23 mai 2014 5 23 /05 /mai /2014 10:35

par Marina Seiler, Alexandre Nolté et Mathieu Pillard

 

La PCR, ou polymerase chain reaction, plus communément appelée réaction en chaîne par polymérase a été découverte au XXème siècle. Son créateur, Kary Mullis, a obtenu un prix Nobel pour cette innovation en 1993 qu’il partage avec son coéquipier Michael Smith. La PCR a pour but de répliquer une séquence d’ADN préalablement ciblée des milliers voire des millions de fois.

 

Pour effectuer une PCR, nous avons besoin d’un thermocycleur, qui comme son nom l’indique permet de chauffer quelque chose selon des cycles.

Thermocycleur.JPG

Nous avons aussi besoin d’un petit tube « Eppendorf » dans lequel l’ADN sera mis quand il sera prêt à aller dans le thermocycleur. Avant de commencer, il faut déjà choisir une séquence d’ADN cible (c’est-à-dire la séquence d’ADN qu’on veut répliquer) et savoir quels nucléotides se situent près de ses limites, car il faut utiliser des amorces adaptées pour pouvoir initier la réplication. Ensuite, il faut des enzymes qui permettront d’accrocher les nucléotides aux brins d’ADN, comme l’ADN polymérase. Cependant, lors d’une PCR, l’enzyme utilisée est la Taq polymérase (enzyme venant d’une bactérie thermophile, donc résistante à la chaleur), et enfin notre « ADN original ».

 

Une fois l’ADN préparé et mis avec tous ces composants dans le thermocycleur, la PCR peut commencer. Ce processus fonctionne sous forme de cycles. Un cycle repose sur 3 étapes :

  • La dénaturation : L’ADN est chauffé à 95°C pour que la double hélice qu’il forme s’ouvre. En effet, sous l’effet de la chaleur, les liaisons faibles qui assurent la cohésion des deux brins se brisent.

  • L’hybridation, qui s’effectue à une température de 45-60°C. C’est à cette étape que les amorces présentes dans le tube vont s’accrocher sur les brins d’ADN en respectant le principe de complémentarité des bases.

  • L’élongation : Cette phase est aussi appelée extension des amorces. C’est là qu’une polymérisation de l’ADN se fera. L’enzyme mise dans le tube va, à partir des amorces, accrocher les nucléotides sur l’ADN, tout en continuant d’appliquer le principe de complémentarité des bases.

     

    Les cycles peuvent aussi êtres expliqués grâce à ce schéma :

Schéma cyclesSchema-cycles2.JPG Comme nous les voyons, la première polymérisation de l’ADN ne s’arrête pas à la longueur voulue mais continue. Les copies de l’ADN ne sont pas à la taille voulue, c’est-à-dire à la taille de la séquence ciblée. Les cycles recommencent, de 20 à 50 fois selon le nombre de séquences d’ADN voulu.

A partir du 4eme cycle, le nombre de séquence d’ADN de la bonne taille obtenu dépasse celui des séquences plus longues, comme le montre ce schéma :



Schema-pcr-courts-et-longs.JPG

 

On peut expliquer cela par le fait que le nombre de séquences d’ADN trop longs évolue de manière linéaire tandis que le nombre d’amplicons (= molécules d’ADN définies à leurs extrémités) obtenus augmente de manière exponentielle. Le nombre de séquence d’ADN obtenu au total est égal à 2^(n), n représentant le nombre de cycles effectués. Un cycle met environ 5 – 10 minutes à se faire. Vous pouvez aussi retrouver ce principe grâce à cette animation : http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm

Les utilisations scientifiques de la PCR sont très nombreuses ; trop nombreuses pour être recensées. Toutefois, elles peuvent être classées en différentes catégories. Quelques exemples concrets :

 - En médecine :

On utilise la PCR pour les tests génétiques (test de parenté...), la détection d’oncogènes (des gènes pour lesquels des mutations favorisent la survenue de cancers) et les tests de compatibilité pour la transplantation d’organes.
La caractérisation et la détection de virus : La PCR a rendu la détection du VIH (Virus d’Immunodéficience Humaine) beaucoup plus rapide en permettant de détecter un génome viral dans l’ADN (Acide Désoxyribonucléique) prélevé dans 50000 cellules. Elle a également permis l’échantillonnage de différents microorganismes pathogènes, comme celui responsable de la Tuberculose pour, par exemple, évaluer l’efficacité d’un traitement envisagé.

- En criminologie :

La PCR est l’une des étapes fondamentales lors d’une recherche « génétique » d’un criminel grâce a toutes les possibilités que donne une plus grande quantité d’ADN (Plus de détails sur l’identification génétique de criminels sur ce site : http://incc.fgov.be/fr/identification-genetique)

 

Bien sûr ce ne sont que des exemples d’utilisations de la PCR, n’oublions pas que la génétique est une des préoccupations principales de l’Homme actuellement et que la PCR a été un tremplin pour celle-ci.

Sources :

 

Schémas: http://www.bibliomer.com/documents/fiches/fiche_ensavoirplus_lien_PCR_vf.pdf

Infos : Unige.

http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm http://www.bibliomer.com/documents/fiches/fiche_ensavoirplus_lien_PCR_vf.pdf http://en.wikipedia.org/wiki/Applications_of_PCR

http://incc.fgov.be/fr/identification-genetique

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Published by lebioblog - dans BIOTECHNO

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