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19 décembre 2013 4 19 /12 /décembre /2013 13:57

Fracture tes plasmides et découvre l’enzyme !

Par Marina Seiler, Alexandre Nolté et Dylan Terrot

en partenariat avec

banniere 

Le clonage de l’ADN est une technique de plus en plus commune de nos jours, loin de la complexité de la Science Fiction. Nous allons vous présenter la première étape de celui-ci en vous montrant comment il est possible de découper des plasmides (molécules d’ADN circulaires capables de se répliquer d’elles-mêmes que l’on trouve uniquement dans les organismes bactériens) qui servent au clonage d’ADN. Le clonage de l’ADN correspond à l’intégration de fragments d’ADN étranger (provenant d'humains par exemple) dans un plasmide.

Pour voir un exemple de clonage :

http://bioutils.unige.ch/experiences/exp_clonage.php

 

Plusieurs étapes ont été nécessaires pour mener à bien notre expérience (réalisée lors de notre visite à l’UNIGE) :

- Extraire les plasmides à partir de bactéries.

- Digérer ces plasmides avec des enzymes de restriction (BamH1 ou MSP1) qui coupent l’ADN à des endroits particuliers en reconnaissant des séquences d’ADN spécifiques, appelées sites de restriction (qui ne sont pas les mêmes pour tous les types d’enzymes de restriction).

Important : le nombre de sites de restriction sur l’ADN du plasmide n’est pas le même pour toutes les enzymes de restriction.

 

Sur l’image ci-dessous, on voit le nombre de sites de restriction en fonction de l’enzyme pour le plasmide utilisé lors de l’expérience (le plasmide pUC19-TIF qui comprend 8297 paires de bases ou pb) ainsi que le nombre de fragments d’ADN obtenus après digestion (et leur longueur) :

 

Image2 ap svt

Pour vérifier que les plasmides ont bien été coupés par les enzymes de restriction utilisées (BamH1 ou MSP1), nous avons effectué une électrophorèse sur gel agarose. Voici une image montrant la préparation du processus (cliquez dessus pour en savoir plus):

Image1 ap svt

Ce processus va permettre de séparer les différents morceaux d’ADN selon leur taille dans un champ électrique. Ici, les morceaux d’ADN vont migrer vers la «borne +» puisque les groupes phosphates présents dans l’ADN sont chargés négativement. Les plus petits morceaux d’ADN vont migrer beaucoup plus loin que les plus gros, qui sont ralentis par leur masse. Comme nous les avons coupés en plusieurs parties, nous allons pouvoir vérifier si le découpage a eu lieu en comptant le nombre de bandes d’ADN différentes.

Voici le résultat obtenu après avoir déposé dans différents puits (numérotés de 1 à 6) toutes les solutions obtenues :

ap4.JPG

Les colonnes non numérotées sont des tests.

 

Après avoir eu toutes ces explications, réussissez-vous à déterminer quelle enzyme a coupé chaque plasmide aux différents puits numérotés de 1 à 6 (reportez-vous au document qui présente le nombre de sites de restriction sur le plasmide) ?

Source images : BioOutils - UNIGE

 

 

 

Solution : Pour chaque puits nous pouvons observer différentes migrations de morceaux de plasmide. Pour les puits 1, 3, 4, 5 chaque ligne de migration obtenue comporte deux bandes d’ADN donc deux morceaux de plasmide. En relation avec le premier document, on peut affirmer que ces plasmides ont été digérés par l’enzyme BamH1, puisqu’il y avait deux sites de restrictions, donc deux fragments d’ADN après digestion. 

Pour les puits 2 et 6, on peut en déduire qu’il y a eu digestion avec Msp1 car on peut voir 13 morceaux. On devrait en obtenir 18, mais comme certains morceaux ont la même taille, ou presque, on ne peut pas les distinguer. Le fait que la digestion n’a pas été complète peut aussi faire varier le nombre de fragments d’ADN obtenu.

 

 

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Published by lebioblog - dans BIOTECHNO

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