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6 février 2014 4 06 /02 /février /2014 12:13

par Loïc Genneret

 

Une enzyme de restriction est une protéine capable de couper un double brin d’ADN au niveau d’une séquence de nucléotides.

 

Il existe plusieurs types d’enzymes de restriction: On distingue trois types d'enzymes de restriction. Les enzymes de type I et de type III reconnaissent une séquence d'ADN et coupent en un endroit aléatoire, d'une distance d'environ 1 000 paires de bases (pb) pour le type I et de 25 pb pour le type III plus loin que le site de restriction (site reconnu par l’enzyme).

 

Les enzymes de type II, les plus utilisées, reconnaissent une séquence spécifiqueet coupent en un endroit spécifique de la séquence d'ADN.

 

Utilisation de ces enzymes: On se sert des enzymes de restrictions de type II en génie génétique. Cette science consiste en l’intégration d’un gène au sein de l’ADN d’une bactérie afin que celle-ci reproduise la protéine issue du gène dont on voudrait exploiter les capacités.

 

Fonctionnement : Découvrez en images l’utilisation d’une enzyme de restriction pour intégrer un gène (un gène humain, par exemple) dans un plasmide bactérien.

 

http://www.youtube.com/watch?v=aA5fyWJh5S0


L’essentiel (extraits de la vidéo) :


photo 1 L’enzyme de restriction (en bleu) se fixe sur la séquence d’ADN qu’elle doit sectionner.

 

enzyme de restriction, fixation de l'enzyme sur le site de

 

photo 2 Après section l’enzyme se libère de l’ADN et laisse apparaître les « sticky-ends », des «bouts collants».

 

enzyme de restriction, rupture après action de l'enzyme de

 

photo 3 L’ADN découpé se trouve tout apte à l’intégration du gène, celui-ci (représenté par la chaîne rose fluo, à gauche de l'image) se rapproche en frétillant de la zone de raccordement.

 

enzyme-de-restriction--les-bouts-collants.jpg

 

photo 4 La liaison de l’ADN bactérien avec le gène s’apprête à s’effectuer.

 

enzyme-de-restriction--portion-d-ADN-a-inserer.jpg

 

photo 5 Une nouvelle enzyme, la ligase (en vert) entre en jeu, sa fonction consiste à consolider définitivement le gène à l’ADN.

 

enzyme-de-restriction--action-de-la-ligase-pour-consolider-.jpg

 

photo 6 Etat final : le gène est intégré

 

enzyme-de-restriction--etat-final.jpg

 

Exemple et méthode de fonctionnement via ECOR1 :

 

processus-ecoR1.jpg

Le mode d’action de l’enzyme ECOR1 reconnaît puis coupe la séquence GAATTC en laissant des «Sticky-ends». Ensuite la ligase (enzyme de couleur verte dans la vidéo explicative de l’utilisation des enzymes de restriction) permet de recoller le gène extrait de l’ADN. Une fois le gène intégré a son nouveau brin d’ADN il sera fonctionnel et la bactérie porteuse de ce gène va donc produire en masse la protéine caractéristique du gène.

 

Voici ci-dessous plusieurs exemple de zones de coupure d’enzymes de restriction. On observe un contraste entre les raccordements selon l’enzyme qui est utilisée. On remarque ainsi que certaines enzymes «laissent» des bouts francs tandis que d’autres coupent le double brin d’ADN de sorte a laisser des extrémités cohésives.

                                                                                                      image : www.edu.upmc.fr

haell bamh1 pst1 enzyme de restriction

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19 décembre 2013 4 19 /12 /décembre /2013 13:57

Fracture tes plasmides et découvre l’enzyme !

Par Marina Seiler, Alexandre Nolté et Dylan Terrot

en partenariat avec

banniere 

Le clonage de l’ADN est une technique de plus en plus commune de nos jours, loin de la complexité de la Science Fiction. Nous allons vous présenter la première étape de celui-ci en vous montrant comment il est possible de découper des plasmides (molécules d’ADN circulaires capables de se répliquer d’elles-mêmes que l’on trouve uniquement dans les organismes bactériens) qui servent au clonage d’ADN. Le clonage de l’ADN correspond à l’intégration de fragments d’ADN étranger (provenant d'humains par exemple) dans un plasmide.

Pour voir un exemple de clonage :

http://bioutils.unige.ch/experiences/exp_clonage.php

 

Plusieurs étapes ont été nécessaires pour mener à bien notre expérience (réalisée lors de notre visite à l’UNIGE) :

- Extraire les plasmides à partir de bactéries.

- Digérer ces plasmides avec des enzymes de restriction (BamH1 ou MSP1) qui coupent l’ADN à des endroits particuliers en reconnaissant des séquences d’ADN spécifiques, appelées sites de restriction (qui ne sont pas les mêmes pour tous les types d’enzymes de restriction).

Important : le nombre de sites de restriction sur l’ADN du plasmide n’est pas le même pour toutes les enzymes de restriction.

 

Sur l’image ci-dessous, on voit le nombre de sites de restriction en fonction de l’enzyme pour le plasmide utilisé lors de l’expérience (le plasmide pUC19-TIF qui comprend 8297 paires de bases ou pb) ainsi que le nombre de fragments d’ADN obtenus après digestion (et leur longueur) :

 

Image2 ap svt

Pour vérifier que les plasmides ont bien été coupés par les enzymes de restriction utilisées (BamH1 ou MSP1), nous avons effectué une électrophorèse sur gel agarose. Voici une image montrant la préparation du processus (cliquez dessus pour en savoir plus):

Image1 ap svt

Ce processus va permettre de séparer les différents morceaux d’ADN selon leur taille dans un champ électrique. Ici, les morceaux d’ADN vont migrer vers la «borne +» puisque les groupes phosphates présents dans l’ADN sont chargés négativement. Les plus petits morceaux d’ADN vont migrer beaucoup plus loin que les plus gros, qui sont ralentis par leur masse. Comme nous les avons coupés en plusieurs parties, nous allons pouvoir vérifier si le découpage a eu lieu en comptant le nombre de bandes d’ADN différentes.

Voici le résultat obtenu après avoir déposé dans différents puits (numérotés de 1 à 6) toutes les solutions obtenues :

ap4.JPG

Les colonnes non numérotées sont des tests.

 

Après avoir eu toutes ces explications, réussissez-vous à déterminer quelle enzyme a coupé chaque plasmide aux différents puits numérotés de 1 à 6 (reportez-vous au document qui présente le nombre de sites de restriction sur le plasmide) ?

Source images : BioOutils - UNIGE

 

 

 

Solution : Pour chaque puits nous pouvons observer différentes migrations de morceaux de plasmide. Pour les puits 1, 3, 4, 5 chaque ligne de migration obtenue comporte deux bandes d’ADN donc deux morceaux de plasmide. En relation avec le premier document, on peut affirmer que ces plasmides ont été digérés par l’enzyme BamH1, puisqu’il y avait deux sites de restrictions, donc deux fragments d’ADN après digestion. 

Pour les puits 2 et 6, on peut en déduire qu’il y a eu digestion avec Msp1 car on peut voir 13 morceaux. On devrait en obtenir 18, mais comme certains morceaux ont la même taille, ou presque, on ne peut pas les distinguer. Le fait que la digestion n’a pas été complète peut aussi faire varier le nombre de fragments d’ADN obtenu.

 

 

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17 juin 2013 1 17 /06 /juin /2013 14:39

Par Baptiste Pugnat et Iris Rivoire

Starring : Spack, le robot microscophile

 

Pour découvrir en vidéo le fonctionnement et les exemples d'utilisation du microscope optique et du microscope électronique, cliquez ci-dessous sur Spack :

Sans titre

« Le principe des différents microscopes sont étudiés en cours de physique-chimie, Cependant, c’est bien sur un blog de SVT que nous vous expliquons le fonctionnement de cette merveille de technologie. Le textes sont parfois bien pompeux, de ce fait, avec Baptou nous vous avons fait une super vidéo (on y travaille depuis novembre...) sous les ordres du terrifiant M.Guichot (qui fait des blagues pas drôles.) Le BAC est là, regardez donc ce lien afin de faire une pause culture dans vos révisions. Joyeux BAC, kiffez bien votre vie :) »

Iris

 


 


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19 décembre 2012 3 19 /12 /décembre /2012 15:10

par Sarah-Laure Rincourt

 

Description, explication et comment on procède

La technique d’autoradiographie a pour objectif de marquer  une molécule spécifique (celle-ci se trouvant le plus souvent dans une cellule spécifique) avec de la radioactivité. Le marquage facilite la découverte de l’emplacement de la molécule au niveau des organites cellulaires.

La molécule qu’on recherche va être marquée par certains isotopes radioactifs*. Ceux-ci deviennent les marqueurs ou traceurs de la molécule dans la cellule.

En plus de connaître l’emplacement de la molécule on souhaite connaître son emplacement et son déplacement au cours du temps.

 

Ici un exemple (cliquer sur le lien pour voir l’animation) avec une leucine radioactive (la leucine étant un acide animé): on cherche dans des cellules où sont ces molécules de leucine, à quoi elles servent et dans quelle protéine elle sera utilisée.

Pour les trouver, on utilise alors l’autoradiographie.

Cet animation explique aussi comment se déroule l’autoradiographie.

http://svt.ac-creteil.fr/archives/Media/Med1S/Autoradiographie/autoradiographie.htm

 

Remarque: Après avoir tué les cellules (pour pouvoir analyser l’emplacement de la leucine à un temps t ) les rayons utilisés lors de l’autoradiographie pour analyser le stade des cellules sont les rayons gamma et les particules beta (voir le cours de radioactivité de première) .

 

Aide

- Un isotope (par exemple un carbone avec 14 neutrons) est un atome qui a les mêmes propriétés chimiques que les corps équilibrés (exemple un carbone avec 12 neutrons) puisque le nombre d’électrons et leur répartition dans les différentes couches sont identiques.  = “ même place, même case dans la classification périodique des éléments”

De plus certains isotopes sont stables mais ce n’est pas le cas de tous, on dit que se sont des isotopes radioactifs. En effet l’excès de matière dans le noyau entraîne un déséquilibre et déclenche la transformation d’un neutron en proton plus un électron. Après cette transformation le proton supplémentaire apparu fait changer la nature de l’atome ( le carbone 14 devient de l’azote a 14 neutrons et une émission béta moins).

Il faut savoir qu’un isotope n’est pas radioactif en permanence.  De plus c’est l’émission de béta qui le rend visible. Il se comporte comme l’atome stable et n’est donc pas détectable jusqu’au moment, imprévisible où il y a la transformation.


Des exemples d’autoradiographie avec des images

 

autoradiographie feuille CO2


On peut localiser dans un tissu une activité de l’organe étudié.

 Exemple : On cherche a mettre en évidence l’utilisation de dioxyde de carbone dans la photosynthèse. On prend une feuille d’érable que l’on place dans une atmosphère dans laquelle on a mis du dioxyde de carbone radioactif.

On obtient les résultats suivants : Les zones foncées sur l’image de droite correspondent à la présence de dioxyde de carbone radioactif.

On peut déduire de cette expérience que la photosynthèse a lieu dans les zones où on trouve le dioxyde de carbone radioactif, c’est à dire en bordure des nervures de la feuille.

 

arn autoradiographie
Les deux photographies ci-dessus présentent des autoradiographies de cellules qui ont été cultivées en présence d’un précurseur radioactif spécifique de l’ARN. Chaque tache noire repère un endroit où se trouve de l’ARN ayant incorporé le précurseur radioactif.

Des cellules animales sont cultivées sur un milieu contenant de l’uracile radioactif.
a. Autoradiographie après culture sur milieu radioactif pendant 15 minutes.
b. Autoradiographie après culture sur milieu radioactif pendant 15 minutes puis transfert sur un milieu de culture non radioactif pendant une heure et demie.
L'ARN est formé dans le noyau (a) mais, contrairement à l'ADN, on le retrouve peu après dans le cytoplasme (b).

 On peut donc observer que l’ARN radioactif se déplace.

Sources
http://documents.irevues.inist.fr/bitstream/handle/2042/9156/ASTER_1989_8_81.pdf?sequence=1 Page 6:

http://svt.enligne.free.fr/spip.php?article24

http://www8.umoncton.ca/umcm-gauthier_didier/siitub/radautofluo.html

http://fr.wikibooks.org/wiki/Photographie/Techniques_scientifiques/Autoradiographie

http://www.lfmadrid.net

http://raymond.rodriguez1.free.fr/Textes/1s13.htm

 

Résumé

L’autoradiographie est une technique de laboratoire permettant de localiser des molécules sur une préparation microscopique. Les cellules sont mises en culture dans un milieu contenant un substrat radioactif. Pour localiser une protéine, on utilise un acide aminé (par exemple la leucine) où des atomes d’hydrogène sont radioactifs. Les cellules incorporent ce substrat à leurs propres molécules qui deviennent alors radioactives, on dit qu’elles sont marquées.
Quand la culture s’est développée les cellules sont lavées de manière à éliminer toute trace de substrat radioactif non incorporé à une molécule. Par exemple toute trace d’acide aminé radioactif non incorporé à une protéine.
On réalise enfin une préparation microscopique que l’on dispose sur un film photographique argentique. Celui-ci est impressionné par le rayonnement radioactif. Après développement du film on observe des points noirs sur les clichés aux endroits où se trouvent les molécules marquées.



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14 décembre 2012 5 14 /12 /décembre /2012 16:43

 Un indispensable supplément Géologie dans la rubrique BIOTECHNO

par Séginus Mowlavi et Yves-Marie Ducimetière

 

Le microscope polarisant, qu’est-ce que c’est ?

Regardons d’abord à quoi ça ressemble :

microscope-pol.jpg

Cela ressemble fort à un microscope optique normal, n’est-ce-pas ?

Eh bien, tout à fait ! Il y a juste une légère différence, qui va tout changer : le microscope comporte deux filtres à lumière, un en-dessous des lames à observer, un au-dessus.

 

Que font ces filtres ?

Il faut d’abord savoir que la lumière est composée d’ondes ; chaque onde se propage dans un plan donné :

polarisation-1.jpg

Et les filtres à lumière de notre microscope agissent comme des grilles, qui ne laissent passer que les rayons qui sont dans un plan parallèle aux barreaux de la grille :

 

polarisation2

 

Comme la lumière est émise (ou réfléchie) dans tous les plans, de la lumière passe encore à travers un seul filtre ; ça explique que l’on puisse encore voir à travers un seul filtre.

De même si on met deux filtres l’un sur l’autre, avec leurs “barreaux” dans le même sens, la lumière passe aussi :

pol-3.jpg

Par contre si les deux filtres ont leurs barreaux dans un sens différent; la lumière ne passe plus, car les ondes qui auront pu passer par le premier filtre sont bloquées par le deuxième filtre. On ne voit alors plus rien :

pol-4.jpg

Mais alors quel est l’intérêt d’avoir un microscope polarisant si on ne voit rien à travers ?

En fait on ne voit rien seulement quand il n’y a rien à voir : quand on met une lame de roche entre les deux filtres, on voit quelque chose :

pol-5.jpg

Comment cela se fait-il ?

Les cristaux ont la propriété de changer certaines propriétés de la lumière, dont le plan dans lequel elle se propage.

Cela explique donc qu’on puisse voir quelque chose même avec nos deux filtres dans un sens différent : la lumière qui a réussi à passer par le premier filtre, en passant par les cristaux, va pouvoir “s’adapter” pour passer dans le deuxième filtre.

Incroyable, non ?

Et chaque cristal change la lumière d’une façon différente selon la couleur. Ainsi si on n’observe qu’un seul cristal, seule une couleur pourra être “adaptée” de la bonne façon pour passer le deuxième filtre : ce qu’on observera sera coloré.

 

Et la couleur qui passe dépend évidemment du cristal. Ainsi le microscope polarisant permet de bien distinguer tous les cristaux qui composent une roche, comme dans les photos ci-dessous.

 

 pol 6

 

pol 7

 

Si vous voulez en savoir plus :

- Une description plus détaillée de ce microscope :

http://les.mineraux.free.fr/dossier-mineralo/microscope/microscope.htm

- Si vous arrivez à installer le plug-in QuickTime et si vous avez le haut-débit :

http://www.discip.crdp.ac-caen.fr/svt/cgaulsvt/travaux/Micropol/

- Et enfin un TPE à propos de la biréfringence, le phénomène qui fait que les cristaux font changer le plan de la lumière :

http://rennes.udppc.asso.fr/IMG/pdf/dossier46.pdf

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14 décembre 2012 5 14 /12 /décembre /2012 11:19

par Ambroise Bichot et Amandin Coisne

 

 Qu’est-ce que c’est?

 L’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) a pour but de donner des images remarquablement claires et détaillées des organes et des tissus internes. L’examen prend en général de 15 à 45 minutes. L’IRMf aide les radiologues à examiner de près l’anatomie du cerveau, mais elle peut aussi les aider à déterminer de façon précise quelle partie du cerveau gère les fonctions cruciales comme la pensée, la parole, le mouvement et la sensation. Ces renseignements sont indispensables lorsqu’on planifie une chirurgie ou d’autres interventions. Cette technique permet également d’identifier les tumeurs au cerveau, les AVC.

 

 À quoi ça ressemble?

L’appareil ressemble à un aimant cylindrique fermé, dans lequel le patient est étendu sans bouger pendant quelques minutes.

 

 Comment ça fonctionne?

 Lorsqu’une zone du cerveau est active, ses besoins énergétiques et en oxygène augmentent. Cela provoque donc une augmentation du débit sanguin dans cette zone. L’IRM utilise des ondes radio et électromagnétiques pour obtenir des images du cerveau afin d’ identifier les régions où le débit dans les vaisseaux sanguins augmente, et donc les régions actives .

Dans l’IRMf, le patient effectue une tâche particulière pendant le processus d’imagerie, ce qui augmente le métabolisme dans le secteur du cerveau responsable de cette tâche ce qui se verra sur l’IRMf par une couleur plus chaude (vers le rouge).

Un radiologue analyse ensuite les images obtenues afin d’émettre un diagnostic.

 

Avantages

- repérer les endroits où le cerveau fonctionne normalement, ce qui permet aux chirurgiens d’éviter ces secteurs lors de la chirurgie du cerveau.

- détecter un accident cardiovasculaire au tout début, de sorte que les médecins peuvent commencer un traitement efficace plus tôt.

- aider les médecins à surveiller la croissance et le fonctionnement des tumeurs au cerveau et guider la planification de la radiothérapie ou autre traitement chirurgical.

- On évite l’exposition à la radiation.

- la détection d’anomalies qui pourraient être obscurcies par les tissus des os avec d’autres méthodes d’imagerie.

 

Risques

- Un implant non détecté peut être affecté par le fort champ magnétique.

- Dangereux lors de la grossesse

Limites : manque de recul et d’expérience dans ce domaine assez récent.
 

Expérience pour mieux comprendre le fonctionnement de l’IRMf :

 

On effectue un IRMf montrant l’activité du cerveau au repos : le tableau représente ici le cerveau, et chaque case une zone du cerveau à laquelle est associé un chiffre : 1= activité faible ; 6= activité forte.

 

 

IRM1.JPG

Le patient effectue ensuite une tache précise, on mesure a nouveau l’activité cérébrale :

 

IRM2

 

 

Pour obtenir l’augmentation d’activité du cerveau lorsqu’on passe du repos à une activité précise, on effectue la différence, et on obtient le tableau suivant :

 

IRM3

 

 

Les zones en rouges sont les zones dont l’activité cérébrales a beaucoup augmenté, donc majoritairement responsables de l’action examinée.

 

Exemple en images :

 

IRM-4.jpg

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28 novembre 2012 3 28 /11 /novembre /2012 16:18

par Maxence Bail

 

La chromatographie sur couche mince (CCM) :

 

Cette technique souvent vue pour la première fois en chimie est aussi souvent utilisée en biologie d’où l’intérêt d’expliquer son fonctionnement. Il s’agit d’une méthode séparative permettant l’identification des différents composés d’un mélange. Elle s’effectue sur une fine couche de silice qu’on appelle phase stationnaire et qui est déposée dans une cuve contenant l’éluant. Ce dernier est un solvant utilisé pour la séparation des substances absorbées sur un support. Avant de placer la plaque de silice dans la cuve, le mélange à étudier est posé sur cette dernière. On obtient une migration des molécules du mélange qui est due aux différences d’affinité  des composés du mélange avec la phase stationnaire et la phase mobile (l’éluant). Leur vitesse de migration dépend des forces électrostatiques retenant les composés sur la plaque et de sa solubilité dans l’éluant. De manière générale, les substances de faible polarité migrent plus rapidement que les composants polaires. La polarité est la caractéristique d’une molécule dont les charges négatives et positives sont concentrées les unes à l’opposé des autres, aux deux extrémités de la molécule. Pour plus d’informations sur la réalisation de cette technique, il peut être intéressant de regarder l’animation suivante : http://www.spc.ac-aix-marseille.fr/phy_chi/Menu/Activites_pedagogiques/cap_exp/animations/ccm.swf .
On peut citer de plus un exemple concret : la chromatographie des pigments des végétaux chlorophylliens: http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/Photosynthese/exp22.html. L’image ci-dessous est un schéma d’une CCM.

 

phys 2-separation-caracterisation-especes 03 

 

L’électrophorèse :

 

Cette seconde technique est quant à elle une méthode d’analyse et de fractionnement basée sur des migrations différentes des molécules comme pour la CCM mais qui sont chargées et migrent sous l’effet d’un champ électrique. Elle est principalement utilisée pour séparer l’ADN, l’ARN ou les protéines. Les anions migrent vers l’anode (+) et les cations vers la cathode (-). La technique la plus fréquente est celle qui utilise un support constitué d’acétate de cellulose imbibé d’une solution dite solution tampon dont le pH est déterminé à l’avance. Il  est intéressant de regarder une animation pour mieux comprendre le principe car pour beaucoup des éléments visuels aident plus que des écrits à comprendre: http://www.ac-creteil.fr/biotechnologies/doc_biochemistry-electrophoresis.htm. Dans cette animation, à pH alcalin, les protéines sont toutes chargées négativement.Placées dans un champ électrique, elles se diffusent d’autant plus vite que leur masse moléculaire est faible et qu’elles portent de charges négatives. De plus, un cas concret tel que la mise en évidence du lyzozyme grâce à l’électrophorèse est intéressant à étudier : http://svt.ac-creteil.fr/?Mise-en-evidence-du-lysozyme .
Pour finir, une excellente animation (en anglais) sur l'électrophorèse de l'ADN: http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/gelelectrophoresis.html
 
Schéma du principe de l'électrophorèse:

 

120181620842.jpg

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16 novembre 2012 5 16 /11 /novembre /2012 17:50

lebioblog, c'est reparti !

 

Nouvelle rubrique : BIOTECHNO.

 

Pour comprendre les techniques d'étude des cellules et du vivant. Electrophorèse, chromatographie, autoradiographie, microscopie optique, microscopie électronique, immunofluorescence, IRM...

Autant de techniques à maîtriser pour comprendre les innombrables expériences de biologie moléculaire et cellulaire et l'exploration du corps humain.

Avec en bonus le principe du microscope polarisant utilisé pour l'étude des minéraux.

Au travail, la AP (dream?) team de TS du mardi.

Bientôt en ligne...

 

En route aussi, les travaux du groupe d'AP de 1ere S du mercredi.

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Le Bioblog, C'est Quoi ?

  • : lebioblog
  • : Le bioblog du lycée de Ferney-Voltaire? Des articles, des photos et des vidéos conçus par des élèves du lycée. Rubriques proposées: BIOACTU: des articles sur l'actualité en biologie et en médecine. BIOTECHNO: pour comprendre les techniques utilisées en biologie cellulaire. BIOACTION: le développement durable au lycée.Et plus encore... En bonus, la rubrique BIOWEB: une sélection de sites pour réviser ses cours. Conception et coordination : Jean-Yves Guichot
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