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Fracture tes plasmides et découvre l’enzyme !

Par Marina Seiler, Alexandre Nolté et Dylan Terrot

en partenariat avec

Le clonage de l’ADN est une technique de plus en plus commune de nos jours, loin de la complexité de la Science Fiction. Nous allons vous présenter la première étape de celui-ci en vous montrant comment il est possible de découper des plasmides (molécules d’ADN circulaires capables de se répliquer d’elles-mêmes que l’on trouve uniquement dans les organismes bactériens) qui servent au clonage d’ADN. Le clonage de l’ADN correspond à l’intégration de fragments d’ADN étranger (provenant d'humains par exemple) dans un plasmide.

Pour voir un exemple de clonage :

http://bioutils.unige.ch/experiences/exp_clonage.php

Plusieurs étapes ont été nécessaires pour mener à bien notre expérience (réalisée lors de notre visite à l’UNIGE) :

- Extraire les plasmides à partir de bactéries.

- Digérer ces plasmides avec des enzymes de restriction (BamH1 ou MSP1) qui coupent l’ADN à des endroits particuliers en reconnaissant des séquences d’ADN spécifiques, appelées sites de restriction (qui ne sont pas les mêmes pour tous les types d’enzymes de restriction).

Important : le nombre de sites de restriction sur l’ADN du plasmide n’est pas le même pour toutes les enzymes de restriction.

Sur l’image ci-dessous, on voit le nombre de sites de restriction en fonction de l’enzyme pour le plasmide utilisé lors de l’expérience (le plasmide pUC19-TIF qui comprend 8297 paires de bases ou pb) ainsi que le nombre de fragments d’ADN obtenus après digestion (et leur longueur) :

Pour vérifier que les plasmides ont bien été coupés par les enzymes de restriction utilisées (BamH1 ou MSP1), nous avons effectué une électrophorèse sur gel agarose. Voici une image montrant la préparation du processus (cliquez dessus pour en savoir plus):



Ce processus va permettre de séparer les différents morceaux d’ADN selon leur taille dans un champ électrique. Ici, les morceaux d’ADN vont migrer vers la «borne +» puisque les groupes phosphates présents dans l’ADN sont chargés négativement. Les plus petits morceaux d’ADN vont migrer beaucoup plus loin que les plus gros, qui sont ralentis par leur masse. Comme nous les avons coupés en plusieurs parties, nous allons pouvoir vérifier si le découpage a eu lieu en comptant le nombre de bandes d’ADN différentes.

Voici le résultat obtenu après avoir déposé dans différents puits (numérotés de 1 à 6) toutes les solutions obtenues :

Les colonnes non numérotées sont des tests.

Après avoir eu toutes ces explications, réussissez-vous à déterminer quelle enzyme a coupé chaque plasmide aux différents puits numérotés de 1 à 6 (reportez-vous au document qui présente le nombre de sites de restriction sur le plasmide) ?

Source images : BioOutils - UNIGE

Solution : Pour chaque puits nous pouvons observer différentes migrations de morceaux de plasmide. Pour les puits 1, 3, 4, 5 chaque ligne de migration obtenue comporte deux bandes d’ADN donc deux morceaux de plasmide. En relation avec le premier document, on peut affirmer que ces plasmides ont été digérés par l’enzyme BamH1, puisqu’il y avait deux sites de restrictions, donc deux fragments d’ADN après digestion. 

Pour les puits 2 et 6, on peut en déduire qu’il y a eu digestion avec Msp1 car on peut voir 13 morceaux. On devrait en obtenir 18, mais comme certains morceaux ont la même taille, ou presque, on ne peut pas les distinguer. Le fait que la digestion n’a pas été complète peut aussi faire varier le nombre de fragments d’ADN obtenu.

par Sarah-Laure Rincourt

Description, explication et comment on procède

La technique d’autoradiographie a pour objectif de marquer  une molécule spécifique (celle-ci se trouvant le plus souvent dans une cellule spécifique) avec de la radioactivité. Le marquage facilite la découverte de l’emplacement de la molécule au niveau des organites cellulaires.

La molécule qu’on recherche va être marquée par certains isotopes radioactifs*. Ceux-ci deviennent les marqueurs ou traceurs de la molécule dans la cellule.

En plus de connaître l’emplacement de la molécule on souhaite connaître son emplacement et son déplacement au cours du temps.

Ici un exemple (cliquer sur le lien pour voir l’animation) avec une leucine radioactive (la leucine étant un acide animé): on cherche dans des cellules où sont ces molécules de leucine, à quoi elles servent et dans quelle protéine elle sera utilisée.

Pour les trouver, on utilise alors l’autoradiographie.

Cet animation explique aussi comment se déroule l’autoradiographie.

http://svt.ac-creteil.fr/archives/Media/Med1S/Autoradiographie/autoradiographie.htm

Remarque: Après avoir tué les cellules (pour pouvoir analyser l’emplacement de la leucine à un temps t ) les rayons utilisés lors de l’autoradiographie pour analyser le stade des cellules sont les rayons gamma et les particules beta (voir le cours de radioactivité de première) .

Aide

- Un isotope (par exemple un carbone avec 14 neutrons) est un atome qui a les mêmes propriétés chimiques que les corps équilibrés (exemple un carbone avec 12 neutrons) puisque le nombre d’électrons et leur répartition dans les différentes couches sont identiques.  = “ même place, même case dans la classification périodique des éléments”

De plus certains isotopes sont stables mais ce n’est pas le cas de tous, on dit que se sont des isotopes radioactifs. En effet l’excès de matière dans le noyau entraîne un déséquilibre et déclenche la transformation d’un neutron en proton plus un électron. Après cette transformation le proton supplémentaire apparu fait changer la nature de l’atome ( le carbone 14 devient de l’azote a 14 neutrons et une émission béta moins).

Il faut savoir qu’un isotope n’est pas radioactif en permanence.  De plus c’est l’émission de béta qui le rend visible. Il se comporte comme l’atome stable et n’est donc pas détectable jusqu’au moment, imprévisible où il y a la transformation.

Des exemples d’autoradiographie avec des images

On peut localiser dans un tissu une activité de l’organe étudié.

 Exemple : On cherche a mettre en évidence l’utilisation de dioxyde de carbone dans la photosynthèse. On prend une feuille d’érable que l’on place dans une atmosphère dans laquelle on a mis du dioxyde de carbone radioactif.

On obtient les résultats suivants : Les zones foncées sur l’image de droite correspondent à la présence de dioxyde de carbone radioactif.

On peut déduire de cette expérience que la photosynthèse a lieu dans les zones où on trouve le dioxyde de carbone radioactif, c’est à dire en bordure des nervures de la feuille.

Les deux photographies ci-dessus présentent des autoradiographies de cellules qui ont été cultivées en présence d’un précurseur radioactif spécifique de l’ARN. Chaque tache noire repère un endroit où se trouve de l’ARN ayant incorporé le précurseur radioactif.

Des cellules animales sont cultivées sur un milieu contenant de l’uracile radioactif.
a. Autoradiographie après culture sur milieu radioactif pendant 15 minutes.
b. Autoradiographie après culture sur milieu radioactif pendant 15 minutes puis transfert sur un milieu de culture non radioactif pendant une heure et demie.
L'ARN est formé dans le noyau (a) mais, contrairement à l'ADN, on le retrouve peu après dans le cytoplasme (b).

 On peut donc observer que l’ARN radioactif se déplace.

Sources
http://documents.irevues.inist.fr/bitstream/handle/2042/9156/ASTER_1989_8_81.pdf?sequence=1 Page 6:

http://svt.enligne.free.fr/spip.php?article24

http://www8.umoncton.ca/umcm-gauthier_didier/siitub/radautofluo.html

http://fr.wikibooks.org/wiki/Photographie/Techniques_scientifiques/Autoradiographie

http://www.lfmadrid.net

http://raymond.rodriguez1.free.fr/Textes/1s13.htm

Résumé

L’autoradiographie est une technique de laboratoire permettant de localiser des molécules sur une préparation microscopique. Les cellules sont mises en culture dans un milieu contenant un substrat radioactif. Pour localiser une protéine, on utilise un acide aminé (par exemple la leucine) où des atomes d’hydrogène sont radioactifs. Les cellules incorporent ce substrat à leurs propres molécules qui deviennent alors radioactives, on dit qu’elles sont marquées.
Quand la culture s’est développée les cellules sont lavées de manière à éliminer toute trace de substrat radioactif non incorporé à une molécule. Par exemple toute trace d’acide aminé radioactif non incorporé à une protéine.
On réalise enfin une préparation microscopique que l’on dispose sur un film photographique argentique. Celui-ci est impressionné par le rayonnement radioactif. Après développement du film on observe des points noirs sur les clichés aux endroits où se trouvent les molécules marquées.

par Ambroise Bichot et Amandin Coisne

 Qu’est-ce que c’est?

 L’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) a pour but de donner des images remarquablement claires et détaillées des organes et des tissus internes. L’examen prend en général de 15 à 45 minutes. L’IRMf aide les radiologues à examiner de près l’anatomie du cerveau, mais elle peut aussi les aider à déterminer de façon précise quelle partie du cerveau gère les fonctions cruciales comme la pensée, la parole, le mouvement et la sensation. Ces renseignements sont indispensables lorsqu’on planifie une chirurgie ou d’autres interventions. Cette technique permet également d’identifier les tumeurs au cerveau, les AVC.

 À quoi ça ressemble?

L’appareil ressemble à un aimant cylindrique fermé, dans lequel le patient est étendu sans bouger pendant quelques minutes.

 Comment ça fonctionne?

 Lorsqu’une zone du cerveau est active, ses besoins énergétiques et en oxygène augmentent. Cela provoque donc une augmentation du débit sanguin dans cette zone. L’IRM utilise des ondes radio et électromagnétiques pour obtenir des images du cerveau afin d’ identifier les régions où le débit dans les vaisseaux sanguins augmente, et donc les régions actives .

Dans l’IRMf, le patient effectue une tâche particulière pendant le processus d’imagerie, ce qui augmente le métabolisme dans le secteur du cerveau responsable de cette tâche ce qui se verra sur l’IRMf par une couleur plus chaude (vers le rouge).

Un radiologue analyse ensuite les images obtenues afin d’émettre un diagnostic.

Avantages

- repérer les endroits où le cerveau fonctionne normalement, ce qui permet aux chirurgiens d’éviter ces secteurs lors de la chirurgie du cerveau.

- détecter un accident cardiovasculaire au tout début, de sorte que les médecins peuvent commencer un traitement efficace plus tôt.

- aider les médecins à surveiller la croissance et le fonctionnement des tumeurs au cerveau et guider la planification de la radiothérapie ou autre traitement chirurgical.

- On évite l’exposition à la radiation.

- la détection d’anomalies qui pourraient être obscurcies par les tissus des os avec d’autres méthodes d’imagerie.

Risques

- Un implant non détecté peut être affecté par le fort champ magnétique.

- Dangereux lors de la grossesse

Expérience pour mieux comprendre le fonctionnement de l’IRMf :

On effectue un IRMf montrant l’activité du cerveau au repos : le tableau représente ici le cerveau, et chaque case une zone du cerveau à laquelle est associé un chiffre : 1= activité faible ; 6= activité forte.

Le patient effectue ensuite une tache précise, on mesure a nouveau l’activité cérébrale :

Pour obtenir l’augmentation d’activité du cerveau lorsqu’on passe du repos à une activité précise, on effectue la différence, et on obtient le tableau suivant :

Les zones en rouges sont les zones dont l’activité cérébrales a beaucoup augmenté, donc majoritairement responsables de l’action examinée.

Exemple en images :