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7 février 2017 2 07 /02 /février /2017 16:17

Par Pierre-Adrian BOLZAN, Leona PODVORICA et Adrian SONNEMANN.

 

On cherche à connaître l'efficacité de divers antibiotiques et de bactériophages sur la bactérie E. coli (Escherichia coli) que l’on retrouve dans nos intestins. Pour cela on réalise un antibiogramme:

 

Premièrement, on a étalé les bactéries E. coli sur une gélose nourricière. Puis, on a soigneusement déposé une pastille imbibée de Céfotaxime, une pastille de Polymyxine B et une dernière pastille de Ticarcilline, trois antibiotiques. On a également déposé une mini goutte d’une solution contenant des bactériophages, c’est-à dire des virus spécifiques des bactéries, pour montrer leur efficacité sur les bactéries E.coli. Ceci est une nouvelle méthode utilisée dans certains pays d’Europe de l’Est pour soigner des maladies d’origine bactérienne (cf article et vidéo “les phages au secours de la médecine”).

Dans un deuxième temps, les boîtes sont placés pendant douze heures dans une armoire de culture permettant ainsi à la fois la multiplication des bactéries sur la gélose et la diffusion des antibiotiques et des bactériophages.

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Ainsi, en regardant le résultat de l’antibiogramme ci-dessus, on peut observer des taches plus ou moins transparentes. Ces taches correspondent aux endroits  où les bactéries sont mortes et n’ont pas pu se multiplier (les zones opaques correspondent à des millions de bactéries). On peut donc identifier les antibiotiques efficaces pour tuer les E. coli et révéler l’action des bactériophages.

On observe que les bactériophages et l’antibiotique Polymyxine B tuent les bactéries E. coli puisque les taches sont transparentes. De plus, l’antibiotique Céfotaxime a plus diffusé mais semble moins efficace car la tache qui l’entoure est moins transparente comparée aux taches correspondant à la Polymyxine B et aux bactériophages. Il faudrait faire des expériences complémentaires pour prouver son efficacité moindre. Au contraire, l’antibiotique Ticarcilline n’a pas d’effet sur ces bactéries puisqu’elles se sont multipliées malgré sa diffusion dans la gélose.

BON A SAVOIR :

Les bactéries peuvent être groupées en 2 catégories:

- Les Gram +

- Les Gram –

On peut en effet les distinguer grâce à la technique de coloration Gram mise au point en 1884 par Hans Christian Gram. Après la coloration, les Gram + apparaissent en violet et les Gram -, en rose. Cette technique est une étape essentielle dans l'analyse médicale, elle permet la visualisation facile de la bactérie, de sa forme et de sa taille.

Le protocole que nous avons utilisé est détaillé dans ce lien :

https://www.bioutils.ch/protocoles/5-la-coloration-de-gram

Bactéries Gram+ et Gram- (source : BiOutils)

Bactéries Gram+ et Gram- (source : BiOutils)

 

A la découverte des différents types de bactéries

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La réalisation de l'antibiogramme.

Dernière étape : le dépôt des bactériophages, au centre.

 

La coloration des bactéries.

Attention, ça tache ! 

 

Observation des bactéries Gram+ et Gram-

 

Encore un grand merci à Karl Perron et à son équipe pour nous avoir permis de réaliser ces expériences et de visiter l'unité de recherche en microbiologie de la Faculté des Sciences de Genève.

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10 juin 2016 5 10 /06 /juin /2016 06:30
Comment extraire un plasmide ?

Le clonage moléculaire consiste à insérer un fragment d'ADN choisi dans un plasmide bactérien (molécule d'ADN distincte de l'ADN chromosomique). Le nouveau plasmide est ensuite introduit dans une cellule hôte, en général la bactérie Escherichia coli.
La vidéo ci-dessous présente la manipulation réalisée à la Faculté des Sciences de Genève pour extraire un plasmide à partir d'une suspension de bactéries.
Une vidéo réalisée par Sonia Bahi, Oriana Testini et Bianca Zuccheli.

Cliquez sur le lien :

https://www.youtube.com/watch?v=nuOhgRAL0CQ&feature=youtu.be

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10 février 2016 3 10 /02 /février /2016 07:54

Prélever et préparer son ADN pour pouvoir l'étudier, rien de plus facile !

Un coton tige, quelques tubes et quelques solutions pour extraire et conserver l'ADN de vos cellules, vous voilà prêts pour en obtenir de grandes quantités en effectuant une PCR afin de l'étudier grâce une électrophorèse, notamment pour savoir si vous êtes un mutant...

Attention de bien manipuler la micropipette !

Visionnez les étapes du protocole utilisé et suivez les conseils pour l'utilisation d'une centrifugeuse.

Cliquez sur le lien : https://www.youtube.com/watch?v=Z2g3ubkqpow

Une vidéo conçue et réalisée par Cameron Bell et James Craden

A l'assaut de l'ADN

Séquences de la vidéo filmées à la Faculté des Sciences de Genève avec le concours de BiOutils.  http://www.bioutils.ch/

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20 janvier 2016 3 20 /01 /janvier /2016 18:36

Très utilisée en laboratoire, la micropipette sert à effectuer des prélèvements de liquides.

Suivez les conseils des apprentis biologistes qui l'ont testée pour vous lors d'une expérience de biologie moléculaire.

Une vidéo conçue et réalisée par Myriam Djouka, Sarah Hanke, Julie Mazillet et Laureen Moret.

https://www.youtube.com/watch?v=1SyWqyubNZg

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17 novembre 2015 2 17 /11 /novembre /2015 09:09
Au coeur des machines de la Faculté des Sciences

Les élèves de l'AP "recherche scientifique" ont poussé la porte de la salle 16 de la Faculté des Sciences de Genève il y a quelques jours.

Ils ont cohabité avec les innombrables machines et outils au service de l'étude des cellules et des molécules du vivant.

Ils ont extrait leur ADN pour étudier leur génotype. lls vous expliqueront très prochainement la meilleure manière d'utiliser une micropipette, une centrifugeuse, une cuve à électrophorèse... Des conseils techniques et astuces en image.

 

Au coeur des machines de la Faculté des Sciences

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Au coeur des machines de la Faculté des Sciences

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Au coeur des machines de la Faculté des Sciences

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Au coeur des machines de la Faculté des Sciences

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Au coeur des machines de la Faculté des Sciences

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Au coeur des machines de la Faculté des Sciences

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Au coeur des machines de la Faculté des Sciences

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Au coeur des machines de la Faculté des Sciences

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Bientôt en ligne...

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15 juin 2015 1 15 /06 /juin /2015 12:39

par Sarah Bernaudin, Lucas Chaleyssin, Malo Cresson, Yannick Di Paolo et Elina Gunsing

L’espèce humaine possède des capteurs, les bourgeons du goût, permettant de distinguer les différentes saveurs : sucré, salé, amer, acide et umami.

Nous nous intéresserons ici plus particulièrement au goût amer, qui n'est pas présent chez tous les individus.

Le goût amer se détecte grâce à la molécule de phénylthiocarbamide ( PTC ) qui se place sur le récepteur TAS2R38, une protéine codée par un gène situé sur le chromosome 7. Ce gène possède deux allèles, celui qui correspond à la sensibilité est dominant tandis que l'autre est récessif. Ainsi chaque individu peut être soit homozygote dominant (2 allèles de sensibilité), homozygote récessif (2 allèles ne définissant pas la sensibilité) ou encore hétérozygote (un allèle dominant et un récessif, l'individu est sensible). Mais comment le déterminer ?

Le génotype est identifiable grâce à une PCR (Polymerase Chain Reaction) suivie d'une électrophorèse), comme l'a fait le groupe précédent : http://www.lebioblog.com/article-y-a-t-il-des-mutants-dans-le-lycee-123887126.html

La PCR consiste en une amplification de milliards de fois d'un unique fragment d'ADN. Dans notre cas, nous avons pu utiliser une machine qui utilise une PCR en temps réel qui se distingue de la PCR quantitative. Grâce à cette nouvelle technique on n'utilise plus l'électrophorèse car il devient possible de réaliser la PCR en 1 heure au lieu de 4 heures et il est possible de déterminer les allèles présents en temps réel.

Un cycle de PCR consiste en une séparation de l'ADN à haute température, puis une diminution de la température pour ensuite avoir une reconstitution de l'ADN par l'enzyme polymérase. Lors de cette reconstitution, s’insèrent deux types de sondes taqman, complémentaires à un motif particulier (séquence) de nucléotides, l'une se fixe sur l'allèle "sensible" et l'autre sur l'allèle "non sensible". Celles-ci permettent de repérer chaque type d’allèle dans chaque cas. Le fonctionnement des sondes est le suivant: lors de la duplication de l'ADN ces sondes se fixent sur un brin d'ADN puis pendant la réplication de celui-ci les sondes sont détachées du brin d’ADN ce qui provoque de la fluorescence, verte dans le cas où l'allèle est "non sensible" et bleue dans le cas où l'allèle est "sensible". Ainsi on peut déterminer si l'individu est hétérozygote (les deux couleurs sont présentes) ainsi l'individu est sensible à l'amertume. Dans un second cas l'individu est homozygote récessif (seule la couleur verte est présente) et l'individu est donc insensible à l'amertume. Dans le dernier cas l'individu est homozygote dominant (la couleur bleue est présente), il est donc sensible à l'amertume.

Le principe de l'utilisation des sondes taqman pour l'identification des allèles

Le principe de l'utilisation des sondes taqman pour l'identification des allèles

Les résultats obtenus pour une personne hétérozygote

Les résultats obtenus pour une personne hétérozygote

Dans le graphique visualisé pendant le déroulement de la PCR, la courbe verte représente la fluorescence au cours du temps de l'allèle "non sensible", la courbe bleue représente la fluorescence au cours du temps de l'allèle "sensible" et la courbe rouge est un test pour s'assurer du fonctionnement de la machine. Plus la fluorescence est importante plus l’allèle est amplifié.

Une détermination du génotype en live par PCR

A partir de ces résultats, on trace le graphique (présenté ci-dessous) illustrant l'intensité lumineuse de l’allèle "sensible" et de l’allèle "non sensible". Il y a 10 échantillons : 8 personnes testées le jour de l'expérience, un contrôle positif C+ hétérozygote et un contrôle C- négatif (pas d'ADN).

On peut constater qu'il y a 3 hétérozygotes c'est a dire qui possèdent deux allèles différents (en vert) : ils possèdent l'allèle "sensible" et l'allèle "non sensible".

Il y a 4 homozygotes c'est-à-dire qui possèdent deux fois le même allèle dont 2 pour l'allèle "sensible" (en bleu) et 2 pour l'allèle "non sensible" (en rouge). Nous pouvons également voir qu'il y a eu un problème avec l'une des personnes qui n'a pas d'ADN (LC), étrange... Petit problème technique plus vraisemblablement.

Une détermination du génotype en live par PCR

Un énorme merci à l'équipe de l'UNIGE (BiOutils) pour nous avoir permis de réaliser cette expérience d'avant garde.

Illustrations : BiOutils

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8 décembre 2014 1 08 /12 /décembre /2014 16:21

 par Sarah Bernaudin, Lucas Chaleyssin, Manon Eck et Mohamed Ndoye

 

On appelle antigène toute substance étrangère à l'organisme capable de déclencher une réponse immunitaire visant à l'éliminer. On trouve ces antigènes à la surface des bactéries ou des virus. Il s'agit le plus souvent de protéines ou de peptides (fragments de protéines) qui sont reconnus de manière spécifique par des anticorps. Un anticorps est une protéine capable de reconnaître de manière spécifique un antigène particulier. Les anticorps sont produits par les lymphocytes B qui jouent un rôle important dans le système immunitaire.

 

schema-anticorps-2.JPG

Dessin montrant la reconnaissance d’un antigène par un anticorps d’un lymphocyte B.

 

Le test ELISA (Enzyme-Linked Immuno Assay) permet de détecter la présence d’un anticorps spécifique dans un échantillon de sang. Ici nous allons tester le sang de deux patients pour savoir s’ils ont été en contact avec le VIH, et donc s’ils présentent les anticorps spécifiques au VIH. Le terme VIH désigne le Virus de l’Immunodéficience Humaine. Lorsqu’une personne est infectée par ce virus, celui-ci va détruire progressivement certaines cellules qui coordonnent l’immunité (c’est-à-dire les défenses de l’organisme contre les microbes).

 

Le test réalisé est le suivant :

 

étape 1 

Fixation de l’antigène : L’antigène connu (fragment du VIH), spécifique à l’anticorps du VIH, est déposé au fond d’un puits. L’antigène se fixe de manière électrostatique. Les puits sont ensuite lavés pour enlever les antigènes non fixés.

 

 

 

 

etape-2.JPG

  

Fixation de l’anticorps à doser : On dépose notre échantillon à doser (sérum contenant ou non l’anticorps), ainsi que nos standards (solution contenant des concentrations connues d’anticorps) dans différents puits remplis d’antigènes. Les anticorps spécifiques dit anticorps primaires, s’ils sont présents, vont se fixer aux antigènes. Un lavage des puits est nécessaire pour enlever les anticorps non fixés

 

 

  

etape-3.JPG

Fixation de l’anticorps secondaire : On dépose ensuite un anticorps secondaire couplé à une peroxydase (enzyme qui transforme une molécule, le TMB, en produit coloré). C’est l’anticorps secondaire qui va reconnaître l’anticorps primaire. Un lavage des puits est nécessaire pour enlever les anticorps secondaires non fixés





 

étape 4

Révélation : On dépose le TMB spécifique à l’enzyme peroxydase. Si la réaction est positive (présence de l’anticorps recherché, ceux du VIH), le TMB va être transformé et induire une coloration bleue. Ainsi on saura que le patient est porteur du VIH car il présente des anticorps contre cette maladie. Il est séropositif. Au contraire si la solution reste incolore le patient n’est pas atteint du VIH.

 

 

 

 

L’intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité d’enzyme présente et donc à la concentration d’anticorps recherchés.Plus la coloration est bleue est plus le patient présente d’anticorps.

 

Résultat 1 : L’échantillon du patient 1 n’est pas coloré.

L’anticorps secondaire qui possède l’enzyme peroxydase n’est pas présent, ce qui veut dire qu’il n’y a pas d’anticorps primaires, car les anticorps primaires permettent aux anticorps secondaires de se fixer. On peut donc en conclure qu’il n’y a pas d’anticorps primaires compatibles avec ces antigènes dans le plasma testé. L’individu 1 n’a donc pas été en contact avec l’antigène, il n est donc pas séropositif (séro=sérum qui signifie plasma).

 

test-4.JPG

 

Résultat 2 : L’échantillon du patient 2 est coloré en bleu.

La couleur est bleue, cela veut dire que l’anticorps secondaire possédant l’enzyme peroxydase est présent. Ainsi le TMB s’est transformé en molécule bleue. Or les anticorps secondaires ont besoin de se fixer sur les anticorps primaires pour agir. Donc il y a des anticorps primaires compatibles avec les antigènes dans le plasma. Donc l’individu 2 a été en contact avec l’antigène et donc séropositif.

Test-3.JPG Illustrations : BiOutils

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28 novembre 2014 5 28 /11 /novembre /2014 16:56

par Katerina Foka Sandoval et Valentin Gobert

 

NEW ! Improve your english

For the english version; have a look below.


Qu’est ce que la syphilis ?

La syphilis est une maladie vénérienne (sexuellement transmissible), qui peux être mortelle, causée par le Treponema pallidum ou tréponème.

La faculté du tréponème à modifier sa surface le rend difficile à combattre pour le système immunitaire qui peine à le reconnaître. Le détecter rapidement pour pouvoir traiter les patients devient alors primordial.

image-1.JPG

Le treponema pallidum

 

La fonction des anticorps :

Les anticorps produits par des cellules du système immunitaire (lymphocytes B) possèdent des parties variables qui leur permettent de reconnaître les corps étrangers, ou antigènes, comme les protéines de surface du tréponème, et s’y fixer (fig.1).

image 4figure 1

 

L’utilisation des anticorps dans le cas de l’immunofluorescence :

En laboratoire, les anticorps utilisés pour reconnaître les antigènes (par exemple les bactéries) sont appelés anticorps primaires.

On ajoute en plus des anticorps secondaires munis d’un composé fluorescent qui permet de le visualiser sous UV. Ces derniers se fixent sur l’anticorps primaire (voir fig 2 et fig.3) ce qui permet de mettre en lumière le composant étudié.

Cette technique peut être utilisée pour différentes bactéries si on possède les anticorps spécifiques capable de détecter leurs antigènes.

image 3image 5

Figure 2                                                      Figure 3 

La visualisation du tréponème au microscope.

Le microscope à fluorescence est composé d’une lampe à arc qui émet une lumière qui, après avoir été filtrée, produit des UV. Les UV vont être projetés sur l’échantillon qui va être excité et les composés fluorescents de l’échantillon vont émettre de la lumière. Celui-ci sera donc plus visible au microscope.

image 6

Le microscope à fluorescence : 1.Lampe à arc 2.Filtre d’excitation 3.Miroir dichroïque 4.Objectif 5.Préparation 6.Filtre d’émission 7.Oculaire 

 

La visualisation du Tréponème peut se faire avec la technique présentée au-dessus, c’est à dire que nous prélevons le sérum d’un patient pour vérifier s'il contient ou non les anticorps spécifiques de la bactérie. Par la suite nous introduisons les anticorps secondaires qui vont venir se fixer sur les anticorps primaires. Ces anticorps secondaires portent une partie fluorescente.

Le mécanisme du microscope à fluorescence permet alors de visualiser les bactéries ainsi que d’estimer leur nombre et donc de conclure sur l’état de santé de la personne. Dans la photo, les tréponèmes sont bien visibles, et le patient à intérêt a se soigner !

IFT Helico 03[1]

Et comme l’a si bien dit Sarah lors de notre visite à l’UNIGE, l’oeil collé à l’oculaire du microscope à fluorescence : « Whaouh, c’est trop stylé ! » 

Crédit photos: BIOutils 

 

 

 

 

Syphilis detection through the immunofluorescence technique

 

English version - Translation by Katerina Foka

 

What is syphilis ?

Syphilis is a venereal disease (sexually transmitted), that can result in death in some cases. It is induced by the bacteria Treponema pallidum also calledTreponem.

The ability it has of modifying its surface continually makes it very difficult to fight for the immune system which has some trouble recognizing it.
A fast detection method becomes essential, the patients needing to be treated as soon as possible.

 

The functions of antibodies:

The antibodies produced by the immune system’s cells (B lymphocytes) have two changing parts which allow them to recognize elements from foreign bodies, called antigens, like the surface proteins of the Treponem, and attach to it. (see fig.1).

 

The use of antibodies in immunofluorescence :

In a lab, the antibodies used to recognize different antigens (like the ones from bacteria) are called primary antibodies.

Once the primary ones have attached to the antigens the secondary antibodies who have a fluorescent component are added, this allows UV visualization later. The second antibodies are formatted to detect the first ones and attach to them (see fig.3) this is what helps shed light, quite literally, on the studied components.

This technique can be used to detect different bacteria if one has access to the specific antibodies capable of detecting their antigen.

 

Microscopic visualization of the treponem:

The fluorescence microscope is made up from a lamp whose filtered light produces UVs. These will then be projected on to the sample, The fluorescent components (which react to UV’s) will get excited and produce a visible light that can be observed through the lens. The bacteria are then visible.

Visualizing the Treponem can be achieved through this technique, the serum of the patient has first to be extracted. The secondary antibodies will then be introduced and attach to the primary ones created by the patients immune system. The secondary ones carry a fluorescent part.
The fluorescent’s microscope mechanism allows to visualize the bacteria and to estimate their number, and thus to determine the health state of the patient. In the picture above, the bacteria are well visible, and the patient should be treated fast !

 

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23 mai 2014 5 23 /05 /mai /2014 10:35

par Marina Seiler, Alexandre Nolté et Mathieu Pillard

 

La PCR, ou polymerase chain reaction, plus communément appelée réaction en chaîne par polymérase a été découverte au XXème siècle. Son créateur, Kary Mullis, a obtenu un prix Nobel pour cette innovation en 1993 qu’il partage avec son coéquipier Michael Smith. La PCR a pour but de répliquer une séquence d’ADN préalablement ciblée des milliers voire des millions de fois.

 

Pour effectuer une PCR, nous avons besoin d’un thermocycleur, qui comme son nom l’indique permet de chauffer quelque chose selon des cycles.

Thermocycleur.JPG

Nous avons aussi besoin d’un petit tube « Eppendorf » dans lequel l’ADN sera mis quand il sera prêt à aller dans le thermocycleur. Avant de commencer, il faut déjà choisir une séquence d’ADN cible (c’est-à-dire la séquence d’ADN qu’on veut répliquer) et savoir quels nucléotides se situent près de ses limites, car il faut utiliser des amorces adaptées pour pouvoir initier la réplication. Ensuite, il faut des enzymes qui permettront d’accrocher les nucléotides aux brins d’ADN, comme l’ADN polymérase. Cependant, lors d’une PCR, l’enzyme utilisée est la Taq polymérase (enzyme venant d’une bactérie thermophile, donc résistante à la chaleur), et enfin notre « ADN original ».

 

Une fois l’ADN préparé et mis avec tous ces composants dans le thermocycleur, la PCR peut commencer. Ce processus fonctionne sous forme de cycles. Un cycle repose sur 3 étapes :

  • La dénaturation : L’ADN est chauffé à 95°C pour que la double hélice qu’il forme s’ouvre. En effet, sous l’effet de la chaleur, les liaisons faibles qui assurent la cohésion des deux brins se brisent.

  • L’hybridation, qui s’effectue à une température de 45-60°C. C’est à cette étape que les amorces présentes dans le tube vont s’accrocher sur les brins d’ADN en respectant le principe de complémentarité des bases.

  • L’élongation : Cette phase est aussi appelée extension des amorces. C’est là qu’une polymérisation de l’ADN se fera. L’enzyme mise dans le tube va, à partir des amorces, accrocher les nucléotides sur l’ADN, tout en continuant d’appliquer le principe de complémentarité des bases.

     

    Les cycles peuvent aussi êtres expliqués grâce à ce schéma :

Schéma cyclesSchema-cycles2.JPG Comme nous les voyons, la première polymérisation de l’ADN ne s’arrête pas à la longueur voulue mais continue. Les copies de l’ADN ne sont pas à la taille voulue, c’est-à-dire à la taille de la séquence ciblée. Les cycles recommencent, de 20 à 50 fois selon le nombre de séquences d’ADN voulu.

A partir du 4eme cycle, le nombre de séquence d’ADN de la bonne taille obtenu dépasse celui des séquences plus longues, comme le montre ce schéma :



Schema-pcr-courts-et-longs.JPG

 

On peut expliquer cela par le fait que le nombre de séquences d’ADN trop longs évolue de manière linéaire tandis que le nombre d’amplicons (= molécules d’ADN définies à leurs extrémités) obtenus augmente de manière exponentielle. Le nombre de séquence d’ADN obtenu au total est égal à 2^(n), n représentant le nombre de cycles effectués. Un cycle met environ 5 – 10 minutes à se faire. Vous pouvez aussi retrouver ce principe grâce à cette animation : http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm

Les utilisations scientifiques de la PCR sont très nombreuses ; trop nombreuses pour être recensées. Toutefois, elles peuvent être classées en différentes catégories. Quelques exemples concrets :

 - En médecine :

On utilise la PCR pour les tests génétiques (test de parenté...), la détection d’oncogènes (des gènes pour lesquels des mutations favorisent la survenue de cancers) et les tests de compatibilité pour la transplantation d’organes.
La caractérisation et la détection de virus : La PCR a rendu la détection du VIH (Virus d’Immunodéficience Humaine) beaucoup plus rapide en permettant de détecter un génome viral dans l’ADN (Acide Désoxyribonucléique) prélevé dans 50000 cellules. Elle a également permis l’échantillonnage de différents microorganismes pathogènes, comme celui responsable de la Tuberculose pour, par exemple, évaluer l’efficacité d’un traitement envisagé.

- En criminologie :

La PCR est l’une des étapes fondamentales lors d’une recherche « génétique » d’un criminel grâce a toutes les possibilités que donne une plus grande quantité d’ADN (Plus de détails sur l’identification génétique de criminels sur ce site : http://incc.fgov.be/fr/identification-genetique)

 

Bien sûr ce ne sont que des exemples d’utilisations de la PCR, n’oublions pas que la génétique est une des préoccupations principales de l’Homme actuellement et que la PCR a été un tremplin pour celle-ci.

Sources :

 

Schémas: http://www.bibliomer.com/documents/fiches/fiche_ensavoirplus_lien_PCR_vf.pdf

Infos : Unige.

http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm http://www.bibliomer.com/documents/fiches/fiche_ensavoirplus_lien_PCR_vf.pdf http://en.wikipedia.org/wiki/Applications_of_PCR

http://incc.fgov.be/fr/identification-genetique

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6 février 2014 4 06 /02 /février /2014 12:13

par Loïc Genneret

 

Une enzyme de restriction est une protéine capable de couper un double brin d’ADN au niveau d’une séquence de nucléotides.

 

Il existe plusieurs types d’enzymes de restriction: On distingue trois types d'enzymes de restriction. Les enzymes de type I et de type III reconnaissent une séquence d'ADN et coupent en un endroit aléatoire, d'une distance d'environ 1 000 paires de bases (pb) pour le type I et de 25 pb pour le type III plus loin que le site de restriction (site reconnu par l’enzyme).

 

Les enzymes de type II, les plus utilisées, reconnaissent une séquence spécifiqueet coupent en un endroit spécifique de la séquence d'ADN.

 

Utilisation de ces enzymes: On se sert des enzymes de restrictions de type II en génie génétique. Cette science consiste en l’intégration d’un gène au sein de l’ADN d’une bactérie afin que celle-ci reproduise la protéine issue du gène dont on voudrait exploiter les capacités.

 

Fonctionnement : Découvrez en images l’utilisation d’une enzyme de restriction pour intégrer un gène (un gène humain, par exemple) dans un plasmide bactérien.

 

http://www.youtube.com/watch?v=aA5fyWJh5S0


L’essentiel (extraits de la vidéo) :


photo 1 L’enzyme de restriction (en bleu) se fixe sur la séquence d’ADN qu’elle doit sectionner.

 

enzyme de restriction, fixation de l'enzyme sur le site de

 

photo 2 Après section l’enzyme se libère de l’ADN et laisse apparaître les « sticky-ends », des «bouts collants».

 

enzyme de restriction, rupture après action de l'enzyme de

 

photo 3 L’ADN découpé se trouve tout apte à l’intégration du gène, celui-ci (représenté par la chaîne rose fluo, à gauche de l'image) se rapproche en frétillant de la zone de raccordement.

 

enzyme-de-restriction--les-bouts-collants.jpg

 

photo 4 La liaison de l’ADN bactérien avec le gène s’apprête à s’effectuer.

 

enzyme-de-restriction--portion-d-ADN-a-inserer.jpg

 

photo 5 Une nouvelle enzyme, la ligase (en vert) entre en jeu, sa fonction consiste à consolider définitivement le gène à l’ADN.

 

enzyme-de-restriction--action-de-la-ligase-pour-consolider-.jpg

 

photo 6 Etat final : le gène est intégré

 

enzyme-de-restriction--etat-final.jpg

 

Exemple et méthode de fonctionnement via ECOR1 :

 

processus-ecoR1.jpg

Le mode d’action de l’enzyme ECOR1 reconnaît puis coupe la séquence GAATTC en laissant des «Sticky-ends». Ensuite la ligase (enzyme de couleur verte dans la vidéo explicative de l’utilisation des enzymes de restriction) permet de recoller le gène extrait de l’ADN. Une fois le gène intégré a son nouveau brin d’ADN il sera fonctionnel et la bactérie porteuse de ce gène va donc produire en masse la protéine caractéristique du gène.

 

Voici ci-dessous plusieurs exemple de zones de coupure d’enzymes de restriction. On observe un contraste entre les raccordements selon l’enzyme qui est utilisée. On remarque ainsi que certaines enzymes «laissent» des bouts francs tandis que d’autres coupent le double brin d’ADN de sorte a laisser des extrémités cohésives.

                                                                                                      image : www.edu.upmc.fr

haell bamh1 pst1 enzyme de restriction

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Le Bioblog, C'est Quoi ?

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